动态资讯

国家模式与特色实验细胞资源库成功构建稳定表达Cas9蛋白的人肿瘤细胞株

 近日，国家模式与特色实验细胞资源库成功构建一批稳定表达Cas9蛋白的人肿瘤细胞株。这些新研发的细胞资源可作为工具细胞直接用于后续基因编辑操作，用户只需转入sgRNA序列即可实现靶基因编辑，大大缩短了用户的研发时间和研发成本，也避免了随机整合造成的潜在危害。该研发体系的建立有助于提高基因编辑的高效性和准确率，对于寻找疾病治疗靶点、建立动物模型等具有重要的研究和应用价值。

 近年来，很多文章报道了应用CRISPR/Cas9技术在不同细胞中实现基因敲除、插入和突变的成功案例。然而，目前的基因编辑技术多数采用慢病毒或逆转录病毒载体，这种随机整合方式可能导致细胞出现未知的基因改变、插入点附近基因沉默或随机表达不相关基因等情况，甚至产生染色质结构改变而出现致死性或者有害表型，给后续的细胞传代、实验结果重复等方面带来诸多不利影响，已经成为该技术广泛应用的难题之一。如何建立一种高效、安全、便捷的细胞基因编辑方案成为整个技术研发过程中的重要步骤。AAVS1安全位点位于人类第19号染色体上，外源基因插入到该位点能在不影响细胞正常生命活动的情况下确保插入基因长期、稳定的表达。因此，采用基于该安全位点的基因定点插入技术，可有效降低随机插入给基因组带来的未知改变风险。

国家模式与特色实验细胞资源库在以往对小鼠基因组安全位点Rosa26进行基因修饰的基础上，开展了人肿瘤细胞基因组安全位点AAVS1定点插入Cas9基因的研发工作。技术人员首先设计并构建了能表达sgRNA、Cas9蛋白表达基因、AAVS1基因同源序列、抗生素筛选标记基因和荧光标记基因的载体。随后通过抗生素嘌呤霉素（puromycin）和绿色荧光GFP筛选阳性细胞株。经过单克隆建系后，利用PCR技术和蛋白免疫印迹法验证供体载体携带的DNA片段是否被特异整合到AAVS1位点以及Cas9蛋白的表达，并将稳定表达Cas9蛋白的人肺癌细胞命名为A549 Cas9-copGFP-1（图1）。为了检验单克隆细胞株的基因编辑能力，技术人员将lethal sgRNA（如果发生CRISPR/Cas9基因编辑就能使细胞死亡）转染A549 Cas9-copGFP-1细胞。通过显微镜观察发现，转染lethal sgRNA的细胞出现死亡，而转染阴性对照sgRNA的细胞无明显变化，从而证实稳定表达Cas9蛋白的A549细胞具有基因编辑能力。目前，该细胞株已申请国家发明专利，并按要求备份于中国典型培养物保藏中心。

图1. 稳定表达Cas9蛋白细胞株的验证

A：基因插入A549 Cas9-copGFP-1细胞AAVS1位点的 PCR验证结果；

B：蛋白免疫印迹法检测A549 Cas9-copGFP-1细胞Cas9蛋白表达结果；

C：A549 Cas9-copGFP-1荧光显微图。

国家模式与特色实验细胞资源库一直致力于实验细胞资源的研发和应用，为国内广大用户提供优质的细胞资源和技术服务。今后，我库将继续深入探索基因编辑技术在细胞资源领域的应用，为生物医学基础研究与转化应用提供更好的支撑和保障。

原新闻链接：https://mp.weixin.qq.com/s/pKXzfUwQErroDaIwG0rr9w

 新闻已有1382人次浏览